60Coγ射线辐照剂量对牛血清白蛋白结构的影响

2021-11-08 13:16:29 浏览次数：

60Coy射线辐照剂量对牛血清白蛋白结构的影响摘要为研究60Coy射线辐照剂量对牛血清蛋白结构 的影响，以单一组分牛血清白蛋白（BSA）为模型，研究BSA 水溶液辐照050 kGy剂量后的含量、结构和微观形态变化。

　　结果表明，BSA主要由25214 kDa约10种分子量的蛋白质 组成，其中 55 kDa 的蛋白质含量最大，各组分含量随辐照剂 量的增加而下降，辐照50 kGy时几乎全部降解；BSA在210、280 nm 处各有 1 个紫外吸收峰，峰高均随着剂量的增加而下 降，辐照30 kGy时280 nm处的峰消失；BSA二级结构中a - 螺旋、B -折叠和B -转角、无规卷曲含量分别为 40.8、37.3 和 21.9，a -螺旋含量随辐照剂量增加而下降，其他结构含 量呈上升趋势；辐照前后 BSA的酰胺I带红外吸收峰从 1 650.8 cm-1红移至1 655.5 cm-1处；BSA辐照后微观表面由平 滑变为褶皱，形成松散的片状。辐照后牛血清白蛋白二级结 构发生变化，辐照剂量越大，反应程度越大。关键词 60Coy 射线；牛血清白蛋白；剂量；结构改变 中图分类号 TS201.6； TL99 文献标识码 A 文章编号 0439-8114（2015）21-5378-04DOI 10.14088/ki.issn0439-8114.2015.21.045Effect of 60Coy Rays Irradiation Dose on Bovine Serum Albumin StructureGENG Sheng-rong1，LI Xin1，LI Cha-de2，ZU Xiao-yan1，LIAO Tao1，XIA He-zhou1，YIE Li-xiu1，CHENG Wei1 1.Institute for Farm Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology ，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Innovation Center of Agricultural Science and Technology，Wuhan 430064 ，China；2.School of Chemistry ，Chemical Engineering and Life Sciences，Wuhan University of Technology，Wuhan 430070 ，ChinaAbstract To study the influence of 60Co y ray irradiation dose on bovine serum component ，as a single component model,BSA solution was irradiated by 0 50 kGy respectively and the protein content ，secondary structure molecular and morphology were determined.The results showed that the BSA was mainly composed of 10 proteins and the molecular weights were 25214 kDa，of which the protein content of 55 kDa was the largest one.The protein content was decreased with the increasing of irradiation dose and the content of 10 proteins were degraded after irradiated 50 kGy.The UV-Vis UV-Visible Spectrophotometer of BSA appeared two absorption peaks at 210 nm and 280 nm ，respectively.The height of two peaks were decreased with the dose increasing and 1 280 nm-peakdisappeared after the BSA was irradiated by 30 kGy.The secondary structure content of a -helix,B -fold bovineserum albumin ； dose； structure change牛血清是细胞培养的最重要的组分，它具有促进细胞增 殖和诱导细胞分化等生物学功能，与现代生物技术包括基因 工程、细胞工程、酶工程和发酵工程的发展有密切关系 1 由于原料来源和生产环节引入的外源病毒会影响牛血清的 品质以及下游生物制品的品质 2 ，关于 60Coy 射线灭活病原 菌和破坏细胞的效果早期有大量研究 3 ，4，但对于牛血清 中蛋白组分的生理指标变化未曾涉及，牛血清生物功能的破 坏，根本原因在于蛋白质结构和构象的改变，研究辐照对蛋 白质结构的影响有利于建立高效的辐照工艺。牛血清中的蛋白质可分为纤维蛋白原、白蛋白、a 1球蛋白、a 2球蛋白、B 1球蛋白、B 2球蛋白和丫 -球蛋白等 多种成分5,其中BSA是生物体血浆中含量最丰富的一种载 体蛋白质，约占血浆中总蛋白质的5262,因其能够与多种小分子化合物进行可逆的结合而起到体内转运作用，是 常用的蛋白质模型。BSA是由607个氨基酸残基组成的一种 球蛋白，含有 17 个二硫键，一个自由半胱氨酸基团，为较 大的螺旋形结构。本试验利用紫外光谱UV-Vis、红外光谱FT-IR spectrometer,FT-IR圆二色谱Circular dichroism ,CD和扫描电镜Scanning electron microscope,SEM,研 究辐照后BSA结构的变化，为建立剂量与蛋白质结构变化之 间的关系提供理论参考。1 材料与方法1.1 试剂与仪器BSA分析纯，国药集团化学试剂有限公司；蛋白标样MBP-B -半乳糖苷酶，分子量 175 kDa； MBP-截短型 沖-半 乳糖苷酶，分子量80 kDa；MBP-CBD,分子量58 kDa；CBD-Mxe intein-2CBD,分子量 46 kDa;CBD- Mxe intein，分子量 30 kDa,Thermo 公司。Y射线辐照源60Co源，装源量25.5万居里，湖北省辐照实验中心；扫描电镜（Quanta 200型）,荷兰FEI公司；示差扫描量热仪（DSC200F3型），德国Netzsch公司；红外 光谱仪（ NICOLET 5700型，红外显微镜），美国热电公司； 紫外可见分光光度计（ T6 新世纪），北京普析通用仪器有限 责任公司； 1515 型高效液相色谱泵、2690D 型分离模块、2410 型折射率检测器、Waters ultrahy drogel 2000 型和 Waters ultrahy drogel 250 型色谱柱，美国 Waters 公司；圆二色谱（ J-810 型），日本分光公司（ JASCO）。1.2 试验设计BSA的100 mg/mL水溶液采用有氧包装后，在常温下（约25 C）分别辐照 0、10、20、30、40、50 kGy剂量，另外一 个处理在低温下（约 10 C）辐照10 kGy剂量。辐照方式采 用动态照射法，平均剂量率约为 30 Gy/min 。硫酸亚铁剂量 计跟踪剂量，照完后样品采用十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝 胶电泳（ SDS-PAG）E 方法分析蛋白含量和组分变化；采用UV-Vis、CD、FT-IR SEM表征结构变化，其中 CD测定直接 取样稀释，其他指标测定取辐照后BSA的冻干样。1.3 检测方法SDS-PAGE样品浓度1 mg/mL，微孔滤膜过滤，上样量10卩L。分离胶浓度9,分离胶段电泳电压 100 V,浓缩胶 浓度4,浓缩胶段电泳电压 60 V,电泳时间2.5 h。UV-Vis样品浓度5 mg/mL，蒸馏水溶剂，微孔滤膜过滤，波长扫描范围 190410 nmCD将浓度为0.5 mg/mL的样品注入1.0 cm的石英比色 皿中，以去离子水为对照。控制程序为Spectra manager，气体流量为 45 L/min ，检测波长范围 190260 nm，1 次数据 采集，采集频率 200 nm/min 。二级结构含量根据仪器自带程 序杨氏公式给出。FT-IR取冻干样品与 KBr混合压片，扫描范围4004 000 cm-1 ，分辨率 4 cm-1 。SEM取冻干样品少量黏在金属台上，喷金，电镜扫描。2 结果与分析2.1 BSA辐照后蛋白组分及分子量的变化BSA溶液分别辐照050 kGy后作SDS-PAG分析，见图1。未辐照BSA有10条带，13条分子量大于175 kDa,第 45条在17580 kDa范围，第6条在58 kDa处，浓度相当 大，第79条在4630 kDa之间，第10条小于46 kDa。低 温辐照10 kGy BSA与常温10 kGy相比条带颜色略深，尤其是 在58 kDa处。从20 kGy开始，大于58 kDa的蛋白条带消失，形成均匀的连续分子量的混合物。58 kDa处蛋白条带也逐渐变浅。根据迁移距离和标样蛋白质的分子量计算，各剂量对应的条带分子量见表 1。未辐照BSA主要由214、204、189、172、135、55、38、34、29、25 kDa 这 10 种分子量蛋白质组成，其中55 kDa分子量蛋白含量最大。经1050 kGy剂量辐照后，各分子量蛋白逐渐降解消失，形成混合物。2.2 BSA辐照后UV-Vis光谱吸收变化BSA溶液分别辐照050 kGy后的UV-Vis图如图2所示，未辐照BSA水溶解部分的紫外吸收光谱在210 nm处和280nm处各有1个峰，吸光度分别为 2.74和0.318 L/gcm，随 着剂量的增加峰高逐渐下降，剂量大于30 kGy时，280 nm处的峰消失（图 2）。

　　280 nm 的吸收峰是分子中的 2 个色氨 酸和19个酪氨酸的芳杂环的 n-n *和n- n *跃迁引起的，而 210 nm处的吸收峰是由肽键上的CO的n n *跃迁引起的，与BSA的a -螺旋含量有关6。辐照引起蛋白质构象发生变 化，主要为肽键上的 CO的n n *跃迁能量减小和a -螺旋含 量减少，且与剂量呈正相关，大于20 kGy辐照后样品的210nm 和 280 nm 两个紫外吸收峰高下降尤其明显。2.3BSA辐照后CD变化肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基以及二硫键是主要 的光活性生色基团，生色基团对左右圆偏振光吸收不同，造 成偏振矢量的振幅差，从而得到蛋白质和多肽分子的二级结 构，圆二色谱仪是研究蛋白质构象变化的有效手段。BSA溶液显示（图 3）出 a -螺旋结构的 3 个特征峰，192 nm 处 1 个正峰，208、222 nm 处 2 个负峰，吸收强度反映蛋白 a - 螺旋的含量 7。BSA溶液分别经050 kGy辐照后，测定样品的CD光谱 图 3。随着辐照剂量的增加，192、208和 222 nm 处的 3个峰值均下降，剂量大于 30 kGy时，在192 nm处的峰型发 生变化。用杨氏法计算得到 BSA二级结构中4种结构的含量，详见表2。随着辐照剂量的增加，a -螺旋含量从40.8 0 kGy 下降至10.0 50 kGy,3 -折叠和B转角的总含量从 37.3 增加至 51.3，无规卷曲从 21.9增加至 38.7。2.4 BSA辐照后FT-IR变化牛血清酰胺I带主要是氨基酸残基的CO伸缩振动吸收，是a -螺旋、3 -折叠、转角和无规卷曲等不同结构振动峰的 加合带，各吸收峰范围在 1 600 1 685 cm-1 之间，其中 1 6001 640 cm-1 归属3 -折叠，1 6401 650 cm-1 归属无规 卷曲，1 6501 670 cm-1 归属 a -螺旋，1 6801 685 cm-1 归属转角结构，1 651 cm-1归属a -螺旋8。酰胺带吸收峰 范围1 5001 600 cm-1，包含C-N的伸缩振动和 N-H的变形 振动 9。未辐照和50 kGy辐照BSA溶液红外吸收图谱见图4。未辐照BSA的酰胺I带的红外最大吸收位于1 650.8 cm-1附近，表明BSA以a -螺旋结构为主。辐照BSA吸收峰红移至1 655.5 cm-1处，辐照BSA样品酰胺口带移至 1 536.6 cm-1附近，与 未辐照相比，峰高变高并尖锐。红外吸收变化说明辐照使蛋 白质的构象发生了变化。2.5 BSA辐照后SEM结构变化图5为BSA水溶液或凝胶经冻干后的 SEM图。由图5 可知，未辐照BSA表面光滑，经30 kGy辐照后表面有小量褶 皱和小突起，40、50 kGy辐照处理后表面褶皱增加，小突起 变为大片状突起。本研究结果与耿胜荣等10 明胶溶液辐照后因交联反应微观表面变得粗糙相似。3 讨论在050 kGy辐照范围内，随着辐射剂量的增加，牛血 清白蛋白的主要蛋白组分含量逐渐减少，当大于20 kGy辐照后，仅有4种主要蛋白组分（135、55、34、29 kDa）存在，辐照后BSA蛋白质溶解性变差，微观表面呈现松散的片状结 构，这与明胶水溶液辐照的特性相似 11，明胶水溶液辐照 后蛋白质组分电泳后发生降解反应，蛋白质含量下降，微观 表面形成更为紧密的网状结构。本试验中，a -螺旋含量下降，而B -折叠和B转角、无 规卷曲含量升高，a -螺旋含量在辐照剂量 010 kGy间下降 幅度最大，20 kGy后变缓和，这说明辐照自由基主要作用BSA的a -螺旋结构区域。熊泽云等12报道的镧（川）-芸香甙配 合物与人血清白蛋白反应后 a -螺旋含量下降，其他结构含量 升高，认为二者结合导致人血清白蛋白的构象变化。吴锦绣 等13报道壳聚糖与牛血清蛋白相互作用导致的208和 222nm圆二色谱峰向低波数移动，以及振幅下降，说明BSA发生降解，从而引起组成和结构的变化本试验结果表明，大于 30 kGy辐照的BSA溶液在210、280 nm 处的紫外光谱吸收峰大幅度下降。薛春霞等 6认为，抗生素头孢地尼结构中的羧基解离后，离子诱导BSA肽链伸展，内部的色氨酸和酪氨酸残基芳杂环疏水基团裸露，使 278 nm处吸收增强；罗红霉素分子中的羟基与BSA肽链中的氨基酸残基中的含氧或含氮基团形成氢键，从而使氨基酸残基 中含氧或含氮基团原有的键强减弱，278 nm 处吸收峰下降。

　　本试验中辐射引起的 BSA紫外减色效应，与罗红霉素的作用 效果相同，但结合圆二色谱和扫描电镜结论分析，辐照后的 BSA紫外吸收下降，与 BSA的疏水基团增加，导致溶解性下 降，发色基团含量减少有关，并不是形成了氢键。50 kGy辐照的BSA酰胺I带发生红移，酰胺带峰型变 尖锐，说明a -螺旋含量、C-N、N-H键合力发生改变。这与 安秀林等 8的研究报道相同，也与本试验中圆二色谱变化一 致。4 小结1）未辐照牛血清白蛋白有 10种主要蛋白组分，分子量 分别为 25、29、34、38、55、135、172、189、204、214 kDa，其中55 kDa含量最多。常温高于 20 kGy的牛血清辐照灭菌 剂量明显造成蛋白的分子量降解，低温有一定的抑制作用。2）辐照后BSA紫外吸收峰型和圆二色谱峰型均随着辐 照剂量的增加而下降；随着辐照剂量增加，BSA的a -螺旋结 构含量下降，同时B -折叠、B转角和无规卷曲的含量增加。3 辐照引起BSA微观表面由光滑渐变为片状突起，辐 照引起BSA变性，导致蛋白溶解性变差。参考文献1 刘学平，魏至栋，谢 澎，等 .新生牛血清促牛肾细胞 生长试验测定方法的建立J.微生物学免疫学进展，2010，38 324-27.2 张 强，李树清，李 健，等 .进口胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒污染的检测J中国动物检疫，2013,30 2 55-57.3 王杰，张 健.60COy射线辐照的犊牛血清对细胞培 养及病毒增殖的影响J.畜牧兽医科技信息，2013 1 30-32.4 李福安，李玉凡，鲍松滨 .辐照小牛血清对生物指标影响的初步探讨J 中国辐射卫生，2010,119 3 354-355.5 陆连寿，张秀英，王在时，等.液相色谱法分析牛血清中IgG的方法研究J.分析仪器，2012 3 40-48.6 薛春霞,董社英 .四种抗生素与牛血清白蛋白相互作 用的紫外吸收光谱法研究J.湖北农业科学，2014,53 16 3855-3858.7 FASMAN G D.Circular dichrOsim and the cOnatiOnal anaysis Of biOmOleculesM.New YOrk Plenum Press,1996.738-740.8 安秀林，李庆忠，刘海萍，等 .溴化十六烷基三甲基铵与牛血清白蛋白相互作用的红外光谱研究J.西南师范大学学报自然科学版 ，2005，304 699-702.9 李晓霞，张 萌，罗贤文，等.甲氨蝶呤与牛血清白蛋白相互作用的光谱和分子对接研究J .分析试验室，2013，32641-45.10 耿胜荣，廖 涛，李新，等.60Co- 丫不同剂量辐照 对明胶特性的影响J.食品科学技术学报，2013,31 4 28-31.11 耿胜荣，汪 兰，廖涛，等.60Co- 丫射线辐照剂量 对明胶特性和结构的影响J.原子能科学技术，2014,48 3 512-517.12 熊泽云，张华新，王洪林，等.镧川-芸香甙配合物与人血清白蛋白作用特征的研究J.化学与生物工程，2014,31 5 24-27.13 吴锦绣,李 梅,柳召刚,等.分子量为 3000 的壳聚糖与牛血清白蛋白相互作用的研究J.功能材料，2014 ,45 17 17040-17044.