大蒜素通过抑制凋亡通路减少顺铂诱导的耳毒性研究

2021-11-14 00:26:06 浏览次数：

大蒜素通过抑制凋亡通路减少顺铂诱导的耳毒性研究 第一局部大蒜素通过抑制凋亡通路减少顺铂诱导的听力损失实验目的 我们 利用C57小鼠腹腔注射顺铂制造药物性听力损失模型,用顺铂联合大蒜素腹腔注 射来探讨大蒜素在体内对顺铂诱导的听力损失是否具有保护作用。实验方法 体 内实验所用C57小鼠性别匹配,年龄在7-8周,体重17-23 g。小鼠被随机分为三组 ,每组 30只;第 1 组,0.9生理盐水注射为对照组 ;第 2 组,顺铂注射 ;第3组,顺铂大蒜素注射。第 1 组小鼠给予连续七天腹腔注射 0.9 生理盐水 0.6 毫升/100 克。第 2 组小鼠给予连续七天腹腔注射顺铂 3 毫克/公斤。第 3组小鼠在顺铂 注射前一天腹腔注射大蒜素 18.2 毫克/ 公斤,在接下来的连续七天先腹腔注射 大蒜素 ,2 小时之后再腹腔注射顺铂 3 毫克/ 公斤,用药前和用药后检测三组小 鼠的听性脑干反响ABR,TUNEL凋亡试剂盒检测三组小鼠耳蜗外毛细胞、支持细胞和螺旋神经节神经元的凋亡情况。对三组小鼠耳蜗中剩余的外毛细胞和螺旋神经节神经元进行计数 ,用透射电 镜观察外毛细胞和螺旋神经节神经元中线粒体情况 ,用 Western blot 检测三组耳 蜗组织中 Bax、Bcl-2 、cleaved-caspase-9 、cleaved-caspase-3 的表达情况 ,免疫荧光检测三组小鼠耳蜗外毛细胞中P53的表达和螺旋神经节神经元中细胞色素 -C、cleaved-caspase-9 及 cleaved-caspase-3 的表达情况 ,检测三组小鼠 耳蜗组织中丙二醛MDA和超氧化物歧化酶SOD冰平。实验结果ABR结果表 明,C57小鼠单独腹腔注射顺铂组表现出听觉脑干反响的阈值增加,而大蒜索顺铂组小鼠的听觉功能的大局部频率受到保护。顺铂引起耳蜗外毛细胞及底转、中转的螺旋神经节神经元计数减少 ,大蒜素能保护顺铂引起的耳蜗外毛细胞及耳蜗中转的螺旋神经节神经元损伤。TUNE检测结果显示 顺铂引起耳蜗外毛细胞、支持细胞及耳蜗底转和中转螺旋神经节神 经元凋亡 ,大蒜素能明显地减少顺铂诱导的凋亡情况。透射电镜结果显示 大蒜素能显著地降少顺铂诱导的螺旋神经节神经元中线 粒体的损伤。

　　Western blot 结果显示 顺铂增加耳蜗组织中 Bax、cleaved-caspase-9 、cleaved-caspase-3 的表达,降低 Bcl-2 的表达;大蒜素能 显著地降低耳蜗组织中 Bax、cleaved-caspase-9 、cleaved-caspase-3 的表达 ,增加 Bcl-2 的表达。免疫荧光结果显示顺铂诱导螺旋神经节神经元中细胞色素C的释放、cleaved-caspase-9 和 cleaved-caspase-3 的表达增强 ,诱导外毛细胞、支持细 胞中P53的表达增强，大蒜素能显著地减少螺旋神经节神经元中细胞色素C的释放,cleaved-caspase-9 和cleaved-caspase-3 的表达,减少耳蜗中转、底转外毛 细胞中P53的表达及耳蜗中转支持细胞中P53的表达。此外，大蒜素能降低耳蜗组织中丙二醛水平 ,升高耳蜗组织中超氧化物歧化酶的水平。实验结论大蒜素可有效地预防顺铂诱导的听力损失 ,其中大蒜素通过线粒 体途径保护顺铂诱导的螺旋神经节神经元的凋亡 ,通过p53途径来保护耳蜗外毛 细胞和支持细胞的凋亡。同时大蒜素通过抗氧化作用保护顺铂诱导的耳蜗损伤。第二局部大蒜素通过抑制凋亡通路减少顺铂诱导的前庭毒性实验目的 本研 究的目的是探讨大蒜素对顺铂诱导的小鼠前庭功能障碍的保护 ,并探讨大蒜素对 顺铂诱导的耳前庭毒性的保护作用机理。实验方法本实验所用C57小鼠性别匹 配 ,年龄在 7-8 周,体重 17-23 g 。小鼠被随机分为三组 ,每组 10只;第 1组,0.9生理盐水注射为对照组 ;第 2 组,顺铂注射 ;第3组,顺铂大蒜素注射。第 1组小鼠给予连续七天腹腔注射 0.9 生理盐水 0.6 毫升/100 克 。第2组小鼠给予连续七天腹腔注射顺铂 3毫克/公斤。第 3组小鼠在顺铂 注射前一天腹腔注射大蒜素 18.2 毫克/公斤,在接下来的连续七天先腹腔注射 大蒜素 ,2 小时之后再腹腔注射顺铂 3 毫克/公斤,用药前后都用游泳实验来观 察小鼠的泳姿情况。游泳测试设备为盛有温水的矩形水箱 ,长70厘米,宽 40厘米,深10厘米,小 鼠被放置在水箱的中心和身体与水箱的长轴平行 ,放手,观察小鼠自由游泳的姿 势。小鼠以稳定的姿势游泳 ,头露出水面,评分为 3分。小鼠头露出水面 ,游泳姿势不稳,评分为 2分。小鼠的头部不能向上或不能露 出水面,评分为 0分,这只小鼠必须立即从水中被救出 ,以免被淹死。每组随机抽取 5只小鼠进行游泳试验 ,每只小鼠进行 3次试验,每次 1分钟,每次间隔 10 分钟。交替试验 ,防止过度疲劳影响试验结果。计算游泳得分平均数进行统计分析。测试是在室温下进行的。

　　用免疫荧光方法观察三组实验中小鼠椭圆囊、球囊、壶腹毛细胞纤毛束的外 观和密度。用TUNE试剂盒检测三组实验中小鼠椭圆囊、球囊、壶腹毛细胞的凋 亡情况。用免疫荧光方法检测三组中小鼠椭圆囊、球囊、壶腹毛细胞层和血管层细胞 质中 cleaved-caspase-3 的表达情况及荧光密度 ,用免疫荧光方法检测三组实验 中小鼠椭圆囊、球囊、壶腹毛细胞层和血管层细胞核中 AIF 的表达情况及 AIF 核转移率。

　　实验结果游泳实验结果说明 ,C57 小鼠单独腹腔注射顺铂组表现出前 庭功能受损 ,而大蒜素 顺铂组中大蒜素能显著地保护小鼠的前庭功能注射顺铂 7 天后,顺铂组的椭圆囊、球囊和壶腹毛细胞的纤毛束数量明显减少,纤毛束分布不均和外观不正常 ,然而,顺铂大蒜素组椭圆囊、球囊和壶腹毛细 胞的纤毛束保存较好、外观正常和高密度分布。TUNEL检测凋亡情况对照组没有发现TUNEI染色，在顺铂组的前庭神经节神经元、间质细胞、椭圆囊、球囊、壶腹中毛细胞和支持细胞中发现了TUNEL阳性染色。然而,在顺铂大蒜素治疗组的前庭神经节神经元、毛细胞和支持细胞中都没 有发现TUNEI染色,只有一些间质细胞被TUNEL染色标记。免疫荧光检测 cleaved-caspase-3 结果 在对照组中 ,没有发现 cleaved-caspase-3 染色。在顺铂治疗组中前庭毛细胞层和血管层细胞的细胞质中发现 cleaved-caspase-3 阳性染色。

　　在顺铂 大蒜素组中 ,前庭毛细胞和血管层细胞的 细胞质中 cleaved-caspase-3 的表达明显减少。在顺铂组的前庭毛细胞层和血管层细胞 cleaved-caspase-3 的荧光密度明 显高于对照组 ,而在顺铂大蒜素组,大蒜素显著地降低了前庭毛细胞层和血管层 细胞cleaved-caspase-3的荧光密度。免疫荧光检测 AIF的表达情况在对照组 中,AIF在前庭毛细胞层和血管层细胞质中分布，在细胞核内没有分布。经过 7天的顺铂治疗 ,在前庭毛细胞层和血管层细胞的核区域内发现了强烈 的 AIF 荧光。前庭毛细胞层和血管层细胞中 AIF 核转移率在顺铂组明显高于对照 组;在顺铂大蒜素组,大蒜素显著地降低毛细胞层 AIF 核转移率,但是大蒜素没 有显著地降低血管层细胞 AIF 核转移率。实验结论 腹腔注射顺铂的小鼠 ,在游泳测试中表现出前庭功能障碍 ,这结果 说明小鼠的前庭受损。

　　然而,在大蒜素预处理组 ,大蒜素可以明显地阻止了这些损大蒜素显著地减少顺铂诱导的椭圆囊、球囊、壶腹的毛细胞层和血管层细胞 中 cleaved-caspase-3 的表达 ,也减少了椭圆囊、球囊、壶腹的毛细胞层中 AIF 的核转位。这些结果说明 ,大蒜素通过有效地抑制 caspase 依赖和非 caspase 依 赖的凋亡途径来保护顺铂诱导的前庭功能障碍。因此,大蒜素可能有助于防止顺铂诱导的前庭毒性。